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真核蛋白表达与纯化服务

2020-12-15

　　真核蛋白表达与纯化服务

　　由于应用于该领域的重组蛋白基本上均需要翻译后修饰，以获得与天然分子相同的生物活性，而真核细胞自身具备蛋白折叠和翻译后修饰的功能，因此很多客户选择真核蛋白表达系统，表达高质量的重组蛋白。

　　本公司为您提供毫克级的真核细胞表达与纯化服务，帮助您快速获得满意的实验结果。

　　毕赤酵母(P. pastoris)系统表达与纯化服务

 
主要步骤         内容         交付内容 交付时间
目标基因
全基因合成		 1. 从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列；
2. 根据选用的表达系统对cDNA进行密码子的优化；
3. 合成设计好的基因序列。		 目的基因 （在T载体或常规穿梭载体上）及测序报告 2kb 以下，2周左右
目标基因
亚克隆		 1. 扩增并抽提含有目标基因的载体质粒；
2. 将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上；
3. 测序验证构建质粒的准确性；
4. 可提供表达载体（Ppic 9K系列为主）。		 正确构建的重组表达质粒，含重组质粒的DH5α菌株及测序报告 有模板： 2-3周
无模板： 4周
毕赤酵母表达菌株电转化和筛选 1. 酶切线性化表达质粒；
2. 将表达质粒通过电转化到高效的毕赤酵母表达菌株中；
3. 通过PCR鉴定至少挑选5个阳性克隆；
4. 进行高拷贝菌株筛选；
5.可提供表达菌株：X33、GS115、SMD1168。		 PCR阳性克隆和PCR结果报告以及高拷贝筛选报告 2-4周
毕赤酵母表达菌株筛选 1. 将5个阳性克隆于BMGY培养基中扩增，然后换至BMMY培养基中，并加入甲醇诱导表达目标蛋白；
2. SDS-PAGE电泳检测培养上清中目标蛋白的表达情况，并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达；
3. 如果培养上清中检测不到表达，则通过将上清浓缩20倍作用再检测，或通过Western-blot方法检测目标蛋白表达（客户需要提供相关抗体）。		 阳性克隆菌株及表达筛选结果报告 2周
（不含western blot时间）
毕赤酵母表达菌株表达优化 1. 挑选20个阳性克隆进行常规表达筛选，并对其中表达最好菌株优化表达条件；
2. 对挑选出来的单克隆菌株，优化培养及诱导条件（培养基、菌体密度、甲醇浓度、诱导时间等），提高目标蛋白的表达量。		 三个阳性克隆菌株及优化表达条件结果报告 2周
目标蛋白
表达及纯化		 1. 摇瓶培养1L重组酵母菌，诱导表达目标蛋白；
2. 通过亲和、离子交换、疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白；
3. 通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量；
4. 通过Western-blot验证目标蛋白正确性。		 纯化好的目标蛋白1mg以上及纯化报告，可按客户要求提供含纯化标签（Tag）或切除纯化标签（Tag）的最终蛋白， 纯度最高可达90%以上。 2-3周
（不含western blot时间）
目标蛋白
再加工及详细检测		 1. 内毒素去除、除菌、冻干等进一步加工；
2. 通过HPLC、质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。		 加工后的终产品及相关实验和检测报告 2周
大规模制备 按照小试工艺放大生产规模，制备客户需要的合格蛋白产品。 合格的目标蛋白及服务报告 协商

 

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